[重磅推荐]细胞能量代谢数据归一化处理的方法和策略

一、影响细胞密度和细胞增殖速率的因素

进行细胞能量代谢检测实验时，许多因素会影响细胞密度（每孔细胞数），包括：增殖速率、细胞分化程度、细胞死亡速率和点样速率或细胞粘附效率。增殖速率是关键的，因为大多数依赖贴壁的细胞在进行能量代谢分析之前至少需要经过一次过夜培养，细胞数量在这一培养期间会发生变化。在引入干预措施（如基因修饰、慢性药物治疗等）时了解增殖速率尤其重要，因为这些措施通常会导致细胞生长速率发生变化，因此在分析和解析能量代谢检测数据时必须考虑在内。通过测量每孔细胞数或细胞含量，可将不好控制的最终细胞计数的任何变化进行归一化。

二、归一化方法

1. 总细胞蛋白质

根据总细胞蛋白质进行归一化的过程相对较快且经济，采用几乎任意标准酶标仪即可实现。将细胞裂解，并通常将一部分孔内容物通过Bradford或 BCA 蛋白质检测试剂进行定量分析。图1显示了已根据总细胞蛋白质归一化的原始OCR和ECAR数据。该方法虽然简单易行，但其隐含的假设是，对细胞的任何干预措施都不会明显改变细胞总蛋白质含量。如果细胞处理导致线粒体生物合成发生变化，从而改变细胞的蛋白质含量，那么这种归一化方法就可能出现问题，可能掩盖真正的活性差异[1]。如果不同实验组之间的细胞外基质蛋白质含量存在显著差异，或如果培养板基底包被了含有蛋白质的细胞粘附剂（如胶原蛋白、层粘连蛋白、Matrigel®），则总蛋白质归一化处理也不适用。

图 1.使用 SKOV3 细胞的总细胞蛋白质进行 XF 数据归一化的示例。将细胞以 1 × 104、1.5 × 104、2 × 104、2.5 × 104、3 × 104 细胞/孔点样于 XF96 组织培养微孔板中 (n = 6)，培养 24 小时，然后评估基础和应激 OCR 和 ECAR（由 1.0 µmol/L 寡霉素 + 0.5 µmol/L FCCP 诱导的应激条件，终浓度，箭头）。A) 使用 Cytation 1 计数的 细胞数与总细胞蛋白质值呈线性相关。B) 不同点样密度下的基础和应激状态的原始 OCR 和 ECAR 值。C) 不同点样密度下的基础和应激状态的 OCR 和 ECAR 值（已根据总细胞蛋白质归一化处理）（平均值 ± SD，n = 6）

2. 核 DNA

在总蛋白质或细胞计数可能不相关或不可行的情况下，每孔核 DNA 含量可用于归一化细胞能量代谢速率测定数据[2]。该方法基于以下假设：与上述不适合使用总细胞蛋白质的某些实例不同，核 DNA 含量与细胞数呈线性相关。掺入 dsDNA 的各种荧光或比 色染料通常用于定量分析核 DNA。参考文献 [3] 和 [4] 对这些方法和染料进行了全面综述，包括使用 PicoGreen 和 CyQuant 试剂的示例性数据。与总蛋白质分析一样，建议使用参比 dsDNA（如 λDNA）标准曲线以确保准确定量分析，并允许不同数据组的绝对比较。

3. 细胞计数

针对细胞能量代谢速率数据最稳定的归一化方法包括通过细胞直接原位成像或染色细胞核成像，对微孔板的每孔细胞数进行计数。两种成像方法都需要专用的高通量自动成像仪器，比如安理公司新推出的Falcon S300，该系统可用于直接原位全孔细胞计数和核染色细胞计数。使用可渗透细胞的核染色剂进行成像及定量分析细胞数比直接细胞成像更有优势，流程简单，计数更准确。而直接细胞直接计数需要进行显微图像采集及后续图像分析，因此要求细胞分散良好且形态边界清晰（如 A549 或 SKOV3）。对于分散程度较低的细胞或具有聚集形态的细胞（如 MCF7），核染色方法更适用。图2显示了使用Falcon S300进行原位核染色和计数，然后用于XF 细胞能量代谢表型测试数据归一化（使用 SKOV3 细胞）的示例。

图 2.使用原位核染色和原位细胞计数的细胞能量代谢数据归一化的示例。将 VERO 细胞以 1 × 104、2 × 104、3 × 104 细胞/孔进行点样，培养 24 小时，进行 XF 细胞能量代 谢表型测试，然后进行图像分析。A) 原始 OCR 和 ECAR 随寡霉素 + FCCP 加药+ ROT/AA 加药（分别为 1.0 µmol/L、0.5 µmol/L、0.5 µmol/L 终浓度）而发生变化，包括 20 µmol/L DAPI（2 µmol/L 终浓度）。B) 由 DAPI 荧光标记的细胞核（上图）以及使用 Falcon S300 鉴定和分析的细胞核（下图）的代表性图像。C) OCR 和 ECAR 通过原位核染色细胞计数进行归一化（平均值 ± SD，n = 4）

三、特殊情况：

1.非增殖细胞：包括培养一段时间但不复制的原代和/或有丝分裂后细胞（例如皮层神经元、新生大鼠心室肌细胞、棕色脂肪细胞、分化的 iPSC 等[5, 6]）。通常会在接种到细胞能量代谢组织培养微孔板之前计数细胞，获得初始值。然而，仍然建议在上机检测分析后执行一些相关的归一化方法，将培养过程中分离或丧失活性可能造成的任何细胞损失考虑在内。

2.强制粘附细胞：一些细胞或细胞能量代谢检测的应用需要将细胞强制粘附到细胞能量代谢检测微孔板上，在这些情况下，通常在分析前进行定量细胞计数，并将已知数量的细胞引入每个孔中。同样，在分析后对孔内活细胞数进行评估仍然有用，将分析期间的分离可能造成的任何细胞损失考虑在内。

3.三维样品（例如细胞球体）可以根据样品大小或体积进行归一化。细胞球体通常在单独的容器中生长，从数百个到数千个细胞开始。虽然更难以通过总蛋白质、核 DNA 或细胞计数来评估，但使用细胞球体直径、总球体体积等几何参数可进行计算并用作归一化参数[7] 。

4.分离的线粒体或突触体：使用分离的线粒体或突触体需要在细胞能量代谢分析前定量分析样品蛋白质含量，并接种优化的量。在这些情况下，通常不需要在分析后对线粒体或突触体蛋白进行评估，因此也不需要进行归一化[8, 9]。

四、如何选择归一化方法

归一化方法的初始选择通常以所分析的样品类型开始，本文介绍的归一化技术各自具有各自的优缺点，没有单个归一化方法普遍适用于每种实验设计及后续分析。表1列出了上述归一化方法的主要优点和缺点：

表 1：方法比对

表1注意，所使用的所有归一化方法的核心是假设细胞数和被测信号之间存在线性关系；每个细胞的分析物含量保持不变。但是，这种假设并不总是有效。例如，通过线粒体生物合成而增加代谢活性的细胞，每个细胞都具有更高的 OCR，但是，如果采用总细胞蛋白质归一化方法，则这种呼吸差异可能被低估甚至掩盖。如上文所述，如果疑似出现线粒体生物合成，则总细胞蛋白质不适用于 XF 分析数据归一化，而应采用基因组DNA，或最好采用细胞数。

五、细胞数与细胞活性——需绝对计量细胞数目

归一化细胞能量代谢数据时要考虑的另一重要因素是细胞数与细胞活性之间的关系，即每孔或处理组中有多少细胞具有活性？细胞增殖和/或细胞毒性的正交测量与细胞能量代谢数据结合使用时，这一点尤其重要。如果需要测量细胞活性，则使用不受任何细胞能量代谢分析试剂盒试剂强处理影响的方法至关重要，因为这些试剂会抑制线粒体和/或糖酵解功能。需要注意的是，其中包括依赖于细胞 NAD(P)H 氧化还原酶的活性分析，例如 MTT 和 MTS 分析。如果将测量总细胞 ATP 水平作为细胞活力/增殖的代表，也应谨慎，因为近期研究表明，将细胞 ATP（和 MTT）与绝对细胞数量相关联时存在差异[10]。其他活性分析（包括 MultiToxFluor 细胞毒性分析）与细胞能量代谢分析试剂兼容，并可以在细胞能量代谢分析后使用以获得活细胞与死细胞的比率。注意，细胞活性通常以相对比或百分比表示，因此必须测量细胞的绝对数量以准确归一化 XF 数据。

参考文献

1. Liu, T.F., et al., Sequential actions of SIRT1-RELB-SIRT3 coordinate nuclear-mitochondrial communication during immunometabolic adaptation to acute inflammation and sepsis. J Biol Chem, 2015. 290(1): p. 396-408

2. Lorenz, C., et al., Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell, 2017. 20(5): p. 659-674. e9

3. Quent, V.M.C., et al., Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research.Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2010. 14(4): p. 1003-1013

4. Silva, L.P., et al., Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Anal Chem, 2013. 85(20): p. 9536-42

5. Divakaruni, A.S., et al., Inhibition of the mitochondrial pyruvate carrier protects from excitotoxic neuronal death. J Cell Biol, 2017. 216(4): p. 1091-1105

6. Divakaruni, A.S., et al., Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013. 110(14): p. 5422-5427

7. Jiang, L., et al., Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth.Nature, 2016. 532: p. 255

8. Choi, S.W., A.A. Gerencser, and D.G. Nicholls, Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem, 2009. 109(4): p. 1179-919. Rogers, G.W., et al., High Throughput Microplate Respiratory Measurements Using Minimal Quantities Of Isolated Mitochondria. PLOS ONE, 2011. 6(7): p. e21746 10. Chan, G.K.Y., et al., A Simple High-Content Cell Cycle Assay Reveals Frequent Discrepancies between Cell Number and ATP and MTS Proliferation Assays. PLOS ONE, 2013. 8(5):  p. e63583